Establecimiento e implementación de un protocolo simplificado de expansión y cultivo de Células Madre de Pulpa Dental Humana (DPSCh) / Estabelecimento e implementação de um protocolo simplificado para expansão e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh) / Establishing and implementing a simplified protocol for the expansion and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs)

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

Tratamiento complementario de heridas crónicas con factor de crecimiento estimulante de colonias de granulocitos. A propósito de dos casos clínicos / Granulocyte Colony-Stimulating Growth Factor complementary treatment in chronic wounds. Report of two cases / Tratamento complementar de feridas crônicas com colônias de granulócitos estimulantes do fator de crescimento. Cerca de dois casos clínicos

RESUMEN: Introducción: Independientemente de su etiología, las heridas crónicas, representan un desafío terapéutico debido a que muchas veces son refractarias a tratamientos convencionales. Es por este motivo que en los últimos años se han desarrollado de forma creciente estrategias complementarias en el área de la medicina regenerativa, como: terapias con células madre, ingeniería de tejidos, plasma rico en plaquetas y factores de crecimiento aplicados en las heridas crónicas. Dichas terapias complementarias han mostrado ciertos beneficios en la cicatrización de heridas complejas. Materiales y métodos: Se presentan dos casos clínicos de pacientes con heridas crónicas de diferente etiología, refractarias al tratamiento con cura avanzada de heridas, las cuales recibieron de forma complementaria factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; Filgen®). Se realizaron inyecciones locales de G-CSF a una dosis de 300 mcg/ml en piel peri úlcera en forma semanal completando dos series de cuatro inyecciones cada una. Resultados. Ambos casos presentaron una reducción en el área de las mismas alcanzándose la cicatrización total en un paciente y una reducción del 37% en el otro luego de dos series. El procedimiento fue bien tolerado y no se reportaron efectos adversos relacionados al mismo. Conclusiones: Los resultados obtenidos en estos pacientes mostraron beneficios en la cicatrización con la aplicación del G-CSF. Se requieren de ensayos clínicos controlados que permitan establecer el rol de dicho factor en el tratamiento de las mismas. Por este motivo nuestro grupo de trabajo se encuentra desarrollando un protocolo que permita evaluar este aspecto.

ABSTRACT: Introduction: Regardless of their etiology, chronic wounds, represent a therapeutic challenge because they are often refractory to conventional treatments. Due to this observation, in the last few years, new complementary strategies have emerged in the area of regenerative medicine, including stem cell therapeutics, tissue engineering, platelet rich plasma, and growth factors applied to chronic wounds. These complementary therapies have shown certain benefits in healing of complex wounds. Materials and methods: We present two clinical cases of patients with chronic wounds of different etiology, refractory to advanced and conventional wound treatments, which received complementary granulocyte colony-stimulating growth factor (G-CSF; Filgen®). Local injections with G-CSF were administered weekly in periulcer skin at a dose of 300 mcg/ml, completing two series of four injections each. Results: Both cases showeda reduction in their areas, reaching to total healing inone patient, and a reduction of 37% in the other one after two series of treatment. The procedure was well tolerated and no adverse effects were detected. Conclusions: The results obtained with these patients showed a benefit in cicatrization with the administration of G-CSF. Controlled clinical trials are needed to establish the role of G-CSF in these wounds. Thus, our group is developing a protocol to evaluate this aspect.

RESUMO: Introdução: Independentemente da sua etiologia, as feridas crônicas representam um desafio terapêutico porque muitas vezes são refratárias aos tratamentos convencionais. É por esta razão que nos últimos anos foram desenvolvidas estratégias complementares na área da medicina regenerativa, tais como: terapias de células estaminais, engenharia de tecidos, plasma rico em plaquetas e fatores de crescimento aplicados a feridas crônicas. Tais terapias complementares mostraram certos benefícios na cicatrização de feridas complexas. Materiais e métodos: Dois casos de pacientes com feridas crónicas de diferentes etiologias, refractárias ao tratamento com a cura da ferida avançado, que receberam complementaria factor estimulante forma de colónias de granulócitos (Filgen® FEC-G) presente. As injeções locais de G-CSF foram feitas a uma dose de 300 mcg / ml na pele peri úlcera, semanalmente, completando duas séries de quatro injeções cada. Resultados: Ambos os casos mostraram uma redução na área do mesmo atingindo a cicatrização total em um paciente e uma redução de 37% no outro após duas séries. O procedimento foi bem tolerado e nenhum efeito adverso relacionado a ele foi relatado. Conclusões: Os resultados obtidos nestes pacientes mostraram benefícios na cura com a aplicação de G-CSF. Ensaios clínicos controlados são necessários para estabelecer o papel desse fator no tratamento deles. Por esse motivo, nosso grupo de trabalho está desenvolvendo um protocolo que nos permite avaliar esse aspecto.

Angiogênese coronariana como resposta endógena da isquemia miocárdica no adulto / Coronary angiogenesis as an endogenous response to myocardial ischemia in adults / Angiogénesis coronaria como respuesta endógena de la isquemia miocárdica en el adulto

O processo de angiogênese envolve uma sequência complexa de estímulos e respostas integradas, como estimulação das células endoteliais (CE) para sua proliferação e migração, estimulação da matriz extracelular, para atração de pericitos e macrófagos, estimulação das células musculares lisas, para sua proliferação e migração, e formação de novas estruturas vasculares. Angiogênese é principalmente uma resposta adaptativa à hipóxia tecidual e depende do acúmulo do fator de crescimento induzido pela hipóxia (FIH-1 α) na zona do miocárdio isquêmico, que serve para aumentar a transcrição do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores VEGF-R, pelas CE em sofrimento isquêmico. Esses passos envolvem mecanismos enzimáticos e proteases ativadoras do plasminogênio, metaloproteinases (MMP) da matriz extracelular (MEC) e cinases que provocam a degradação molecular proteolítica da MEC, bem como pela ativação e a liberação de fatores de crescimento, tais como: fator básico de crescimento dos fibroblastos (FCFb), VEGF e fator de crescimento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, vem a fase intermediária de estabilização do novo broto neovascular imaturo e a fase final de maturação vascular da angiogênese fisiológica. Como conclusões generalizáveis, é possível afirmar que a angiogênese coronária em adultos é, fundamentalmente, uma resposta parácrina da rede capilar preexistente em condições fisiopatológicas de isquemia e inflamação.

The process of angiogenesis involves a complex sequence of stimuli and integrated responses, such as stimulation of endothelial cells (ECs) for their proliferation and migration, stimulation of the extracellular matrix (ECM) for the attraction of pericytes and macrophages, stimulation of smooth muscle cells for their proliferation and migration, and formation of new vascular structures. Angiogenesis is mainly an adaptive response to tissue hypoxia and depends on the accumulation of the hypoxia-inducible factor (HIF-1α) in the ischemic myocardial area, which increases the transcription of the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors VEGF-R by the ECs undergoing ischemia. Those steps involve enzymatic mechanisms and plasminogen activator proteases, metalloproteinases (MMP) of the ECM, and kinases that cause proteolytic molecular degradation of the ECM and activation and release of growth factors, such as: basic fibroblast growth factor (bFGF), VEGF, and insulin growth factor-1 (IGF-1). In the intermediate phase, stabilization of the immature neovascular sprout occurs. The final phase is characterized by vascular maturation of the physiological angiogenesis. In conclusion, coronary angiogenesis in adults is fundamentally a paracrine response of the preexisting capillary network under pathophysiological condition of ischemia and inflammation.

El proceso de angiogénesis involucra una serie compleja de estímulos y de respuestas integradas, como la estimulación de las células endoteliales (CE), para su proliferación y migración, estimulación de la matriz extracelular, para la atracción de pericitos y macrófagos, estimulación de las células musculares lisas, para su proliferación y migración, y formación de nuevas estructuras vasculares. La angiogénesis es principalmente una respuesta adaptativa a la hipoxia tisular y depende de la acumulación del factor de crecimiento inducido por la hipoxia (FIH-1 α) en la zona del miocardio isquémico, que sirve para aumentar la transcripción del factor de crecimiento endotelial vascular (con sus siglas en inglés: VEGF vascular endotelial growth factor), y sus receptores VEGF-R, por las CE en el sufrimiento isquémico. Esos pasos aglutinan mecanismos enzimáticos y proteasas activadoras del plasminógeno, metaloproteinasas (MMP) de la matriz extracelular (MEC), y cinasas que provocan la degradación molecular proteolítica de la MEC, como también la activación y la liberación de factores de crecimiento, tales como: factor básico de crecimiento de los fibroblastos (FCFb), VEGF y factor de crecimiento insulínico-1 (FCI-1). Posteriormente, viene la fase intermedia de estabilización del nuevo brote neovascular inmaduro y la fase final de maduración vascular de la angiogénesis fisiológica. Como conclusiones generales, podemos afirmar que la angiogénesis coronaria en adultos es fundamentalmente, una respuesta paracrina de la red capilar preexistente en condiciones fisiopatológicas de isquemia e inflamación.

Revascularización miocárdica biológica complementaria a la revascularización miocárdica quirúrgica convencional. Comunicación preliminar de estudio prospectivo de casos y controles, randomizado y doble ciego / Biological myocardial revascularization complementary to conventional surgical myocardial revascularization Preliminary communication of a prospective, randomized, double-blind case-control study

Introducción: la revascularización miocárdica quirúrgica (RVMQ) incompleta es un factor determinante en la reaparición precoz de angina y determina una menor sobrevida para los pacientes. Objetivo: el objetivo del presente trabajo es evaluar la eficacia perfusional de la terapia angiogénica celular con células derivadas de la médula ósea (CMO) autólogas por inyección directa intramiocárdica complementaria a la RVMQ convencional. Material y método: la evaluación perfusional luego de la cirugía se realiza a los tres, seis y 12 meses mediante SPECT y ecocardiograma Doppler Tisular-Strain (DTI-Strain). Resultados: en esta comunicación preliminar (precedida por ocho casos pilotos) se reportan resultados de cuatro pacientes (dos casos y dos controles) que completaron el seguimiento al tercer mes, teniendo todos oclusión crónica de coronaria derecha (CD) sin recanalización, fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) media de 50%. En los territorios de la descendente posterior (DP) y posterolateral (PL) de CD se inyectó un promedio de 5,7 x 106 células CD34+ autólogas en un volumen promedio de 5 ml por territorio. En el control perfusional con SPECT al tercer mes de los casos se registró un incremento perfusional en los territorios inyectados de aproximadamente 10%. En los controles, los sectores miocárdicos no revascularizados tuvieron un decremento perfusional en promedio de 3%. En el DTI-Strain se observó mejoría de los valores en todas las muestras estudiadas en el caso con FEVI conservada, y peoría en el caso con FEVI en rango inferior. La terapia celular angiogénica con CMO autólogas por vía intramiocárdica tiene beneficios prefusionales, es una técnica factible y segura complementaria al tratamiento quirúrgico.

Summary Introduction: incomplete surgical myocardial revascularization is a determining factor for early flare of subsequent angina which results in lower patient survival. Objective: the present study aims to evaluate the perfusional efficacy of cell angiogenic therapy, using autologic bone-marrow derived stem cells, by means of direct intramyocardial injections, as a complementary therapy when combined with myocardial surgical revascularization. Method: perfusional assessment subsequent to surgery is performed after three, six and twelve months with Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) and DTI-Strain. Results: the present preliminary communication/notice (preceded by eight pilot cases) reports results obtained in four patients (two cases and two controls), completed follow-up in the third month, all of which evidenced chronic right coronary (RC) occlusion with no reversal, 50% average left ventricle ejection fraction. An average of 5.7 x 106 CD34+ autologic cells was injected into the descending posterior and posterolateral territory. The average injection volume was 5 ml per territory. Upon SPECT perfusional control in the third month, a 10% perfusional increase was detected in the injected territories. As to the control cases, nonrevascularized myocardial sectors evidenced a perfusional decrease of 3%, on average. DTI-Strain showed values improvement for all samples studied in the case of the preserved left ventricle ejection fraction (LVEF), and worsening in the LVEF lower range. Angiogenic cell therapy by intramyocardial autologic bone-marrow stem cells implies perfusional benefits. It is a feasible and safe technique to complement surgical treatment.

Résumé Introduction: la revascularisation myocardique chirurgicale (RVMQ) incomplète est un facteur primordial à la réapparition précoce d’angine et détermine une survie raccourcie des patients. Objectif: le but de ce travail est d’évaluer l’efficacité de perfusion de la thérapie angiogénique cellulaire avec des cellules extraites de la moelle osseuse (CMO) autologues par injection directe intra-myocardique complémentaire à la RVMQ conventionnelle. Matériel et méthode: l’évaluation de la perfusion post-chirurgicale est faite trois, six et douze mois après avec SPECT et échocardiogramme Doppler Tisular-Strain (DTI-Strain). Résultats: dans cette communication préalable, précédée de huit cas pilotes, on reporte les résultats de quatre patients (deux cas et deux contrôles) ayant complété le suivi au bout de trois mois et présentant tous occlusion chronique de coronaire droite (CD) sans recanalisation, fraction d’éjection du ventricule gauche (FEVG) moyenne de 50%. Dans les territoires de la descendante postérieure (DP) et postéro latérale (PL) de CD on a injecté une moyenne de 5,7 x 106 cellules CD34+autologues dans un volume moyen de 5 ml par territoire. Lors du contrôle de perfusion avec SPECT des cas au troisième mois, on a repéré une hausse de perfusion dans les territoires injectés de 10% environ, les secteurs myocardiques non revascularisés ayant subi une décroissance perfusionnelle de 3% environ. Au DTI-Strain, on a observé une amélioration des valeurs dans tous les échantillons prélevés au cas de FEVG conservée et aggravation au cas avec FEVG à rang inférieur. La thérapie cellulaire angiogénique avec CMO autologues par voie intra-myocardique a des bénéfices de perfusion, est une technique faisable et sûre complémentaire au traitement chirurgical.

Resumo Introdução: a revascularização cirúrgica incompleta do miocárdio (RVCM) é um fator determinante no reaparecimento precoce da angina que implica uma sobrevida menor para os pacientes. Objetivo: o objetivo deste trabalho é avaliar a eficácia perfusional da terapia angiogênica celular com células autólogas obtidas da medula óssea por injeção direta intra-miocárdica como complemento a RVCM tradicional. Material e método: a avaliação perfusional pós-cirurgia é feita aos três, seis e doze meses usando SPECT e ecocardiograma Doppler Tisular-Strain (DTI-Strain). Resultados: nesta comunicação preliminar, (depois de oito casos piloto) relatamos os resultados de quatro pacientes (dois casos e dois controles) que terminaram o seguimento no terceiro mês, todos com oclusão crônica de coronária direita (CD) sem recanalizaçao com fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) média de 50%. Na região do ramo descendente posterior (DP) e póstero-lateral (PL) da CD, injetaram-se uma média de 5,7 x 106 células CD34+ autólogas em um volume médio de 5 ml por região. No controle perfusional dos casos, realizado no terceiro mês, foi registrado um aumento da perfusão nas regiões injetadas de aproximadamente 10%. Nos controles, os setores do miocárdio não revascularizados apresentaram uma redução média da perfusão de 3%. No DTI-Strain foi observada uma melhora dos valores em todas as amostras estudadas no caso com FEVE conservada, e uma piora no caso com FEVE com valor inferior. A terapia celular angiogênica com CMO autólogas por via intra-miocárdica apresenta melhoras da perfusão, é uma técnica viável e segura, complementar ao tratamento cirúrgico.